轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么

    在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，“轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么"是很多新手容易混淆的問(wèn)題。有人說(shuō)是Opti-MEM，有人說(shuō)是DMEM培養(yǎng)基，還有人說(shuō)是轉(zhuǎn)染專用減血清培養(yǎng)基——這些說(shuō)法其實(shí)都不算錯(cuò)，但分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染流程中不同的階段和用途。

    轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基，實(shí)際上指向轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中三種不同功能、不同血清含量的培養(yǎng)基：制備復(fù)合物階段的無(wú)血清或減血清培養(yǎng)基（如Opti-MEM、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基），轉(zhuǎn)染過(guò)程中的含血清培養(yǎng)基（如DMEM+5-10%FBS），以及轉(zhuǎn)染后更換的含血清培養(yǎng)基（培養(yǎng)基）。三者各司其職，用錯(cuò)了階段，轉(zhuǎn)染效率可能大打折扣。

    血清中含有大量的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)可能干擾陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)核酸的吸附，影響轉(zhuǎn)染效率。理解轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么，本質(zhì)上就是在理解血清在不同階段對(duì)轉(zhuǎn)染效率的差異化影響，以及如何通過(guò)合理選擇培養(yǎng)基來(lái)平衡“轉(zhuǎn)染效率"與“細(xì)胞存活率"這對(duì)矛盾。

一、先看核心結(jié)論：三個(gè)階段，三種培養(yǎng)基

    在深入展開(kāi)各類培養(yǎng)基的技術(shù)細(xì)節(jié)之前，先用一個(gè)框架來(lái)回答轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)全流程涉及三種不同功能的培養(yǎng)基——復(fù)合物制備階段用無(wú)血清或減血清培養(yǎng)基（保護(hù)復(fù)合物形成），轉(zhuǎn)染階段可用含血清培養(yǎng)基（維持細(xì)胞狀態(tài)），轉(zhuǎn)染后更換含血清培養(yǎng)基（促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)和表達(dá)）。

    血清對(duì)轉(zhuǎn)染的影響：它會(huì)干擾DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的形成、降低轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)又能為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)因子、減少轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞死亡。因此，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的策略從來(lái)不是“一刀切"地加或不加血清，而是在不同階段有選擇地控制血清的參與程度。

    轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加，如加血清則應(yīng)在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成后加入。接下來(lái)逐一拆解三個(gè)階段的培養(yǎng)基選擇邏輯。

    階段一：復(fù)合物制備——為什么不能含血清？

    轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么？在復(fù)合物制備階段，答案是明確的：這個(gè)階段不能使用含血清的培養(yǎng)基。

    DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不能含血清，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。血清中的蛋白質(zhì)（尤其是帶負(fù)電的蛋白質(zhì)）可能干擾陽(yáng)離子脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑與核酸的結(jié)合，影響復(fù)合物的形成，從而降低轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，血清的存在可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染復(fù)合物不穩(wěn)定，甚至引發(fā)細(xì)胞毒性。

    無(wú)血清的高糖DMEM培養(yǎng)基是稀釋液，不能使用含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行DNA和轉(zhuǎn)染試劑的稀釋，因?yàn)檗D(zhuǎn)染復(fù)合物的形成過(guò)程不能含有血清。

    這一階段常用什么培養(yǎng)基？

    這個(gè)階段常用培養(yǎng)基是Opti-MEMI減血清培養(yǎng)基或無(wú)血清DMEM。Opti-MEM是一種改良型減血清培養(yǎng)基，本質(zhì)上是MEM的改良版本，它和陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑搭配使用時(shí)，能顯著提高轉(zhuǎn)染效率，原因是低血清環(huán)境減少了血清對(duì)轉(zhuǎn)染試劑的干擾，使外源基因更容易進(jìn)入細(xì)胞。此外，轉(zhuǎn)染專用減血清培養(yǎng)基（如Modi-MEM）內(nèi)含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、次黃嘌呤、胸苷和微量元素，這些附加組分可使血清添加量減少至少50%，而細(xì)胞生長(zhǎng)速率或形態(tài)不發(fā)生變化。

    如果手頭沒(méi)有專用的減血清培養(yǎng)基，也可以使用常規(guī)的無(wú)血清DMEM或無(wú)血清1640作為稀釋液。

    抗生素同樣需要注意。在轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備階段，不僅要避免血清，還應(yīng)避免抗生素。由于陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使得對(duì)真核細(xì)胞無(wú)毒的抗生素進(jìn)入細(xì)胞，從而降低細(xì)胞活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。因此，轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備時(shí)建議使用不含雙抗的培養(yǎng)基。

    階段二：轉(zhuǎn)染過(guò)程——血清可以加，但有條件

    轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么？當(dāng)復(fù)合物已經(jīng)形成、加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系中之后，培養(yǎng)基的血清要求就發(fā)生了變化。

    轉(zhuǎn)染可以使用血清，前提是DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不含血清。轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加，如加血清則應(yīng)在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成后加入。也就是說(shuō)，復(fù)合物形成后再加血清是可行的，關(guān)鍵在于復(fù)合物形成的那段時(shí)間不能有血清干擾。

    目前市面上的轉(zhuǎn)染試劑，普遍能在血清存在下不受干擾遞送核酸，因此無(wú)需在轉(zhuǎn)染過(guò)程中去除血清，建議轉(zhuǎn)染時(shí)使用含血清培養(yǎng)基，尤其是比較脆弱的細(xì)胞類型。

    在轉(zhuǎn)染前1小時(shí)，可換用37℃預(yù)熱過(guò)的不含雙抗的培養(yǎng)基，通常含F(xiàn)BS5%，此處血清不影響轉(zhuǎn)染效率。采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率，培養(yǎng)基中也可加入抗生素。

    為什么有血清反而有助于轉(zhuǎn)染？

    血清能提供營(yíng)養(yǎng)因子，幫助細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過(guò)程中維持健康狀態(tài)，減少因轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞應(yīng)激和死亡。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，無(wú)血清條件可能導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)惡化，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    因此，對(duì)于大部分常規(guī)細(xì)胞系（如293T、HeLa等），轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用含5-10%血清的培養(yǎng)基是一個(gè)兼顧轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的選擇。

    階段三：轉(zhuǎn)染后——為什么最好換為含血清培養(yǎng)基？

    轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么？轉(zhuǎn)染完成后，培養(yǎng)基的處理同樣影響最終效果。

    轉(zhuǎn)染后在6小時(shí)左右最好換液且換為有血清的培養(yǎng)基，其一因?yàn)槠胀ㄞD(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用大，其二可降低因血清的缺乏引起的細(xì)胞的死亡。使用脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，轉(zhuǎn)染前換無(wú)血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)再更換成有血清培養(yǎng)基，這其實(shí)是為了減輕轉(zhuǎn)染造成的細(xì)胞毒性。

    加入血清的時(shí)機(jī)也需要注意：加入過(guò)早會(huì)引起未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，過(guò)晚會(huì)引起較多細(xì)胞死亡。可實(shí)時(shí)觀察，當(dāng)約1/5的細(xì)胞變圓的時(shí)候加入血清。

    不同轉(zhuǎn)染試劑的操作差異。部分新型轉(zhuǎn)染試劑（如Entranster）采用有血清轉(zhuǎn)染，不用在有血清和無(wú)血清之間更換，整個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程可以在含血清且含抗生素的培養(yǎng)基中操作，無(wú)需更換培養(yǎng)基。因此，具體是否需要換液、何時(shí)換液，建議以所用轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

二、三種培養(yǎng)基橫向?qū)Ρ龋撼煞?、用途與時(shí)機(jī)

    以下快速對(duì)比幫助理解轉(zhuǎn)染各階段培養(yǎng)基的差異：

    復(fù)合物制備階段：常用Opti-MEM、無(wú)血清DMEM，血清含量為0%，用于稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑、形成復(fù)合物。血清會(huì)干擾復(fù)合物形成，必須無(wú)血清，同時(shí)避免抗生素。此階段是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

    轉(zhuǎn)染過(guò)程：常用DMEM培養(yǎng)基，血清含量為5-10%，用于維持細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過(guò)程中的健康狀態(tài)。復(fù)合物形成后再加入，血清不影響轉(zhuǎn)染，但能減少細(xì)胞死亡。

    轉(zhuǎn)染后更換：常用DMEM培養(yǎng)基，血清含量為5-10%，用于促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)、降低脂質(zhì)體毒性。轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)更換，過(guò)早或過(guò)晚都會(huì)影響結(jié)果。

    不同細(xì)胞的差異化策略：沒(méi)有“一刀切"的答案

    不同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同的。例如HeLa、293、CHO、COS7、MCF-7、HepG2等細(xì)胞，是否加血清對(duì)不同細(xì)胞有不同影響，有些細(xì)胞可以有血清，有些加血清就會(huì)受影響。

    HeLa、293T等常規(guī)細(xì)胞系在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染效率較高，轉(zhuǎn)染過(guò)程中換為含血清培養(yǎng)基有助于維持細(xì)胞存活。原代細(xì)胞、干細(xì)胞等對(duì)血清缺乏敏感的細(xì)胞，建議選擇兼容血清的轉(zhuǎn)染試劑，或全程使用含血清條件。對(duì)于新細(xì)胞系，建議測(cè)試含血清與無(wú)血清條件下的轉(zhuǎn)染效率，選擇合適的方案。

    轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么——一個(gè)完整的操作實(shí)例

    以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞為例，以下流程可幫助理解轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么的實(shí)際應(yīng)用：

    鋪板階段：用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基鋪板，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天達(dá)到70-90%融合度。此階段不需要無(wú)血清條件。

    復(fù)合物制備：將DNA和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別用無(wú)血清DMEM或Opti-MEM稀釋，室溫靜置5-15分鐘形成復(fù)合物。此階段絕對(duì)不能用含血清培養(yǎng)基。

    復(fù)合物加入細(xì)胞：將復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻。此時(shí)培養(yǎng)基中是否含血清取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)——可在復(fù)合物形成后加入血清，也可全程使用無(wú)血清條件。

    轉(zhuǎn)染后換液：轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換為含5-10%FBS的培養(yǎng)基，去除未進(jìn)入細(xì)胞的脂質(zhì)體復(fù)合物，減輕細(xì)胞毒性。

    表達(dá)檢測(cè)：繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率或目標(biāo)蛋白表達(dá)。

總結(jié)

    轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么？歸納起來(lái)就是“階段不同、血清含量不同"的三步判斷邏輯。

    復(fù)合物制備階段——用無(wú)血清或減血清培養(yǎng)基（Opti-MEM、無(wú)血清DMEM），血清含量0%，避免血清蛋白干擾復(fù)合物形成。轉(zhuǎn)染過(guò)程——復(fù)合物形成后，可用含5-10%FBS的培養(yǎng)基，血清不影響已形成的復(fù)合物，反而有助于維持細(xì)胞狀態(tài)。轉(zhuǎn)染后換液——轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)更換為含血清培養(yǎng)基，減輕脂質(zhì)體毒性、降低細(xì)胞死亡率。

    血清在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中是把：它在復(fù)合物形成階段是“干擾源"，在細(xì)胞存活階段是“保護(hù)傘"。理解轉(zhuǎn)染時(shí)用的含血清的培養(yǎng)基是什么，本質(zhì)上就是理解如何在不同階段合理控制血清的參與程度——該禁的時(shí)候禁（復(fù)合物形成），該用的時(shí)候用（轉(zhuǎn)染過(guò)程和后培養(yǎng)）。

    下次做轉(zhuǎn)染時(shí)，不妨先明確手上的轉(zhuǎn)染試劑屬于哪一類（脂質(zhì)體還是新型兼容血清試劑），再根據(jù)細(xì)胞類型和試劑說(shuō)明書(shū)中對(duì)血清的要求，合理選擇各階段的培養(yǎng)基類型和血清濃度。轉(zhuǎn)染效率的高低，往往就藏在這些培養(yǎng)基選擇的細(xì)節(jié)里。

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