科研工作離不開抗體，WB、IP、IHC、IF、ChIP和FC都需要用到抗體，那么這幾種實驗方法中的抗體有什么區(qū)別呢？實驗做不出來，您的抗體選對了么？

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一、關(guān)于特異性的選擇

特異性的選擇主要需要考慮四個方面：蛋白特異性、種屬特異性、實驗方法特異性、標記物的特異性。

1、蛋白特異性

針對需要檢測的蛋白查找抗體，幾個細節(jié)要區(qū)分：

a.重組蛋白如果不是全長表達，則需要注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。

b.內(nèi)源性蛋白最好能清楚其剪切與修飾的方式，特殊表型的蛋白需要進行序列比對，并結(jié)合抗體免疫原序列，查看交叉反應的情況。

c.磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點，不同位點的磷酸化意味著可能有不同的機制存在，不宜一概而論。

2、種屬特異性

同種蛋白不同物種，有著或大或小的差異。

a.目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設計多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性的情況與其他種屬發(fā)生交叉反應。需要參照說明書注明的可反應種屬信息。

b.一些稀有種屬很難找到抗體，可以通過蛋白的序列比對，選擇同源序列免疫的抗體，不過一般這種情況生產(chǎn)商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴，如果可以申請到免費的抗體樣品，則利于抗體選擇。

3、實驗方法特異性

目前使用抗體的實驗方法有很多，不同的使用方法過程中，因為對蛋白樣品的處理方式不一樣，蛋白的含量有差異，對抗體的識別表位和效價要求都是不一樣的。

4、標記物的特異性

一般基于實驗操作的實驗方法不會使用帶有標記的一抗，比如 WB、IHC 等，都是通過二抗類的試劑標記達到結(jié)果呈現(xiàn)的目的。但是基于儀器分析的一些實驗，可能就會使用到直接標記的一抗，比如流式實驗。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍，針對不通的參數(shù)要求選擇對應的標記物。在免疫熒光雙標實驗中，需要選配不同的熒光標記物。

二、不同實驗對抗體有什么不同的要求？

在理解上面技術(shù)對抗體需求的區(qū)別之前我們首先要知道這些實驗技術(shù)都需要什么樣的抗體。

1、WB

WB的蛋白經(jīng)過加熱變性之后都變成線性的結(jié)構(gòu)。因此zuihaode抗體是采用非常特異序列的人工合成多肽的方法來做實驗，結(jié)果也非常特異。

2、IP/CHIP

我們用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此IP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體來做，也可以用純化的重組蛋白的抗體。最好不要用人工合成多肽制作的抗體，因為這種抗體識別的位點可能被深深地藏在了蛋白的內(nèi)心深處。CHIP和IP沒有太大的區(qū)別，weiyi的問題在于，如果抗體識別的表位和該蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的部位一致，則會導致CHIP實驗的失敗。

3、 IF/IHC

免疫熒光和免疫組化中需要進行固定一步，固定是為了盡量讓細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學物質(zhì)的固定使蛋白質(zhì)變性凝固，與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結(jié)構(gòu)。因此在做IF/IHC實驗中，最合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體（多肽是在蛋白質(zhì)的表面）

4、FC

流式細胞中分為兩種，一種是活細胞的流式，這種流失最好采用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來做，另外一種是經(jīng)過固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗體一致。在做流式細胞中，我們有直接標記和間接標記，間接標記不如直接標記真實準確。因此我們選擇流式抗體要采用帶有熒光標記的抗體；如果研究的蛋白沒有直接標記的抗體，那么就采用間接標記抗體，需要添加熒光二抗。

三、怎樣選擇適合你實驗需要的抗體？

1. 一抗選擇要點：

a.確定抗體的名字。注意中英文名字、它名、亞型等信息。

b.確定你的實驗類型。Elisa，WB，IHC，ICC，還是FACS。一般抗體的說明書都會列出該抗體經(jīng)驗證過適用于何種實驗的類型，如果抗體說明書沒有提及的應用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種實驗驗證，請根據(jù)說明書列出的已驗證的類型來選擇適合你實驗的抗體。

c.確定實驗樣本的種屬。Human，Mouse，還是Rat。一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過適用于何種物種實驗，請根據(jù)說明書列出已驗證的種屬來選擇適合你實驗的抗體。

d.樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，待測樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域和樣本在提取和處理過程中是否會變性，蛋白空間構(gòu)象的改變，會影響抗體的免疫親和反應。

e.單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

2. 二抗選擇要點：

a.種屬來源。主要根據(jù)一抗種屬來源來決定購買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。

b.標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標記的二抗，以與后面的SP結(jié)合反應，而免疫熒光染色就需要購買不同熒光素標記的二抗。

四、常見的問題

Q1. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎？

不一定能通用。流式是用直接標記還是間接標記？如果是直接標記的話，那這個抗體一般不是FITC標記或者就是TRITC，PE之類的。如果恰好你的免疫組化，也是想用熒光素標記的抗體來直接標記，那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標記的話，或者是間接標記的話，就有麻煩，因為熒光素的標記很可能會影響二抗和一抗的結(jié)合。

Q2. 為什么我的抗體做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何實驗？

首先恭喜你有一個WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次，你這個抗體很可能是通過人工合成多肽得到的，和上面所述，你用來做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質(zhì)的中心，因此只能識別WB中線性的部分。

Q3. 如何選擇免疫組化抗體？

首先，一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體，單克隆抗體特異性強，靈敏度低；多克隆抗體靈敏度高，特異性弱。根據(jù)你的實驗結(jié)果，如果非特異多，那么選擇單克隆抗體；如果陽性信號弱，不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來源的都是多克隆，小鼠來源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識別什么種屬的抗原，抗體說明書上面一般注明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來源。比如我們在人的癌組織中做p53的免疫組化，一抗我們采用的是小鼠來源的p53抗體，那么二抗我們一定要選擇抗小鼠的二抗比如（山羊抗小鼠，兔抗小鼠），這一點非常重要。最后，一般的抗體說明書都會注明能做什么實驗，如果標明了不可以做免疫組化，一定不要選擇；反過來說，即使標明了可以做免疫組化，也不一定能夠做，商家只會夸大其效果。

Q4. WB和IF的二抗是一樣的嗎？

很明顯，不是！免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗的，是用FITC或PE等標記的抗體，結(jié)果需要紫外線激發(fā)并用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標記的抗體，需顯色底物（如OPDTMB等）直接顯色（肉眼）或化學發(fā)光法顯影（需特殊儀器）。

Q5. 做CHIP的抗體是否可以用來做WB抗體？

不一定，一般來說做CHIP級別的抗體對抗體純度特異性方面都要求比較高，基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識別的是構(gòu)象表位（比如是由兩個實際靠在一起但變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)之后相隔很遠的兩端序列），而不是線性表位，這種CHIP抗體做不了WB。

Q6. 抗體說明書上面沒有寫該抗體能夠用于某項實驗怎么辦？

一般而言，抗體研發(fā)出來之后都要經(jīng)過WB，IP，IF，IHC實驗。檔發(fā)現(xiàn)濃度不夠做IF，IHC時候，國外的抗體一般都是寫未檢測，國內(nèi)的抗體一般是不寫。所以盡量不要抱著試試的心里去嘗試，往往只會浪費時間。你想啊，如果抗體能夠做該實驗，他們肯定會寫上去啊。

Q7. 做ELISA的抗體能否用來做WB？

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000，IF/IHC為1:100，而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個抗體用來做ELISA的，那么言外之意就是該抗體效價不高。但不是說ELISA的抗體不能用于做WB，抗體說明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000，那么你可以試試1:100做做WB

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