自21世紀以來，關于干細胞的基礎研究和應用始終是國內(nèi)外科研領域的一大熱點。根據(jù)我國國家自然科學基金網(wǎng)站的數(shù)據(jù)，每年批準的干細胞相關的國自然課題數(shù)量從2009年開始直線上升，并在2016年達到（658個），近幾年則仍保持在平均每年500-600個的較高水平，可見干細胞研究的火熱。

與普通成體細胞不同的是，干細胞具有自我更新和多向分化潛能的特性，這種特性讓干細胞在某些領域的研究具有其他細胞所不具備的優(yōu)勢。此外，近年來以干細胞為實驗對象的研究，加深了生物學家對基因轉錄、翻譯及表觀遺傳學調(diào)控等生命現(xiàn)象本質(zhì)的認識，也推動了細胞克隆、轉基因、基因編輯等現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，同時，干細胞技術也為一些難治性疾病的臨床治療提供了新的思路。

認識間充質(zhì)干細胞（MSC）

在眾多干細胞中，MSC是研究和應用廣泛的一類，來源于胚胎發(fā)育早期的中胚層，屬于多能干細胞。1968年德國科學家Frieden Stein在骨髓中*發(fā)現(xiàn)了MSC的存在，并成功在體外進行培養(yǎng)；1999年Pittenger等*在體外成功將MSC誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞，證實了MSC的多向分化潛能。2006年，細胞治療協(xié)會（ISCT）規(guī)范了MSC的定義標準：①可貼壁生長；②細胞表面表達特定的特異性標記物；③具有向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的能力。

MSC在機體中含量雖然不多，例如骨髓中每1~10萬個單個核細胞中僅有1個骨髓MSC，但這極小比例的MSC卻在生命活動中發(fā)揮了重要的作用。且MSC分布廣泛，截止到目前，科學家已在骨髓、脂肪、臍帶、牙髓、皮膚等多種組織中均發(fā)現(xiàn)MSC的存在。

MSC的臨床應用

MSC的臨床應用十分廣泛，主要集中在3個方面：①直接細胞移植治療；②作為一種理想的靶細胞用于基因治療；③作為生物組織工程的種子細胞。自2009年第1個適用于膝關節(jié)軟骨缺損修復的干細胞藥物上市以來，截止到目前獲批準上市的干細胞藥物已有14個，一半以上是MSC，主要集中在組織修復和自身免疫性疾病。而根據(jù)Clinical Trials（由美國FDA和NIH共同建立）的數(shù)據(jù)，目前有884項關于MSC的臨床研究正在進行，其中處在Ⅲ期的臨床試驗共50項，其中已完成的有16項，主要疾病種類包括克羅恩病、移植物抗宿主病、心梗、類風濕性關節(jié)炎和軟骨損傷等。

但目前MSC的臨床應用仍存在較多挑戰(zhàn)，雖然已經(jīng)明確一些MSC的適應癥并觀察到不錯的治療效果，但MSC發(fā)揮作用的調(diào)控機制仍有許多環(huán)節(jié)不明確。另外在我國，還沒有建立統(tǒng)一的MSC制備標準，臨床轉化過程中存在較大風險。

MSC的培養(yǎng)與鑒定

相比于胚胎干細胞或神經(jīng)干細胞，MSC具有易獲取、易體外培養(yǎng)、傳代穩(wěn)定性、低免疫原性等優(yōu)勢，在體外經(jīng)過多次傳代后仍具有多向分化和自我復制的潛能，且MSCs多來自于成年的組織，研究過程的道德和倫理學問題較小。

MSC的大小與形狀具有異質(zhì)性，即不同種屬或不同組織的MSC具有不同的生長形態(tài)，例如三極形、長梭形、小圓形、短梭形和扁平形態(tài)。幾乎所有的MSC都是貼壁生長，具有較強的貼壁能力，而MSC的原代分離也正是利用了MSC強貼壁的特性。例如，骨髓MSC的分離方法為：將從組織中分離出來的單個核細胞懸浮培養(yǎng)于含有FBS的培養(yǎng)基中，1~2天后去除非貼壁細胞，保留貼壁細胞再培養(yǎng)2-3周即可獲得。此外也可采用免疫磁珠對MSC進行分選，但這種方法成本較高。

對于MSC的鑒定，常采用的方式包括形態(tài)學鑒定，表面標志物鑒定和多系分化潛能鑒定。MSC一般呈纖維細胞樣生長，細胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細胞中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出2-3厘米長短不同的突起。MSC的細胞表面標志物則常采用流式細胞儀進行鑒定，不同組織來源的MSCs可共享相同的細胞表面標記，如CD29和CD44。但目前我們對MSC表面分子標志物的研究還不完善，已發(fā)現(xiàn)的表面標志物也存在特異性不強的問題，為了讓我們更好地分離、培養(yǎng)和鑒定MSC，需進一步不斷發(fā)現(xiàn)新的特異性標志物。

影響MSC細胞生長的主要因素

相比于細胞系，干細胞對其生長條件要求更為苛刻，稍不注意可能就導致細胞生長速度過慢。那么在培養(yǎng)MSC過程中應注意哪些影響因素呢？

1、血清。血清的質(zhì)量對MSC的擴增起重要作用，優(yōu)質(zhì)的血清可保持MSC高增殖能力并維持分化潛能。

2、接種密度。傳代的密度過低會減弱細胞的自分泌和旁分泌作用，密度過高則有可能出現(xiàn)接觸抑制，從而導致生長緩慢。

3、細胞因子。在基礎培養(yǎng)基中添加一些細胞因子有助于維持MSC的增殖和未分化狀態(tài)。

4、細胞消化時間過長，胰蛋白酶作用時間太長導致細胞貼壁和生長狀態(tài)較差。